Qual a diferença entre limite de resolução é capacidade de aumento?

MICROSCOPIA FOT�NICA

Os principais instrumentos, ainda que n�o os �nicos, empregues no estudo das c�lulas e dos tecidos, s�o os microsc�pios. Existem basicamente duas fam�lias de microsc�pios empregues em biologia: os microsc�pios fot�nicos e os microsc�pioselectr�nicos.

Em biologia, a microscopia fot�nica consiste num conjunto de t�cnicas sequenciais e complementares que visam n�o s� a observa��o de c�lulas ou tecidos de seres vivos mas, tamb�m a prepara��o pr�via desses materiais, e ainda a captura de imagens para posterior observa��o.

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Microsc�pio fot�nico comum

(ou de c�mara clara)

O microsc�pio fot�nico comum, tamb�m designado por microsc�pio de c�mara clara, � um sistema �ptico capaz de fornecer, de um objecto, uma imagem ampliada, permitindo a observa��o de detalhes invis�veis a olho nu. � constitu�do basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objectiva e o conjunto ocular . A objectiva d� do objecto AB uma imagem real A'B', ampliada e invertida . A amplia��oda objectiva, Aob , � dada pela f�rmula :

Aob = A’B’/AB

A amplia��o, � uma das caracter�sticas �pticas essenciais da objectiva. A ocular, por sua vez, fornece de A’B’ uma imagem virtual A’’B’’ muito afastada, mas que, atrav�s do cristalino, se projecta na retina do globo ocular. A amplia��o da ocular � fun��o da dist�ncia focal (foc ) em mil�metros:

Aoc = 250/foc

Entre outras, destacam-se, nos microsc�pios, tr�s caracter�sticas principais: a amplia��o, a abertura num�rica e o poder de resolu��o.

Microsc�pio fot�nico e esquema �ptico de forma��o de imagem

A amplia��oA do microsc�pio � determinada a partir das amplia��es da objectiva e da ocular:

A = Aob x Aoc

Habitualmente, os microsc�pios v�m equipados com diversas objectivas montadas sobre um tambor rotativo (ou revolver), o que permite mudar comodamente de amplia��o no decurso do trabalho. Sendo que as oculares mais comuns possuem uma amplia��o de 10x e a objectiva de maior amplia��o, � de 100x, a amplia��o m�xima habitual do microsc�pio fot�nico raramente ultrapassa o limiar �til de 1000x .

 A abertura num�rica AN da objectiva � dada pela f�rmula:

AN = n. sen a

sendo n o �ndice de refrac��o do meio que se interp�e entre o objecto AB e a lente e a , o �ngulo que forma o raio mais externo captado pela lente frontal da objectiva.

Habitualmente, o meio em contacto com a lente � o ar (n = 1). Por�m, se se substituir o ar por um l�quido cujo �ndice de refrac��o seja superior, pode obter-se um valor superior para a abertura num�rica. Na pr�tica, obt�m-se este efeito imergindo a objectiva numa gota de �leo (�leo de imers�o) cujo �ndice de refrac��o � de 1,51. As melhores objectivas de imers�o possuem uma abertura num�rica que atinge 1,4 .

O poder de resolu��o � a capacidade que o microsc�pio possui de distinguir dois pontos adjacentes. Na pr�tica, o poder de resolu��o � expresso pelo limite de resolu��o e, que � a menor dist�ncia que pode existir entre dois pontos para que apare�am individualizados. Em consequ�ncia, quanto menor for o limite de resolu��o da objectiva, maior ser� o respectivo poder de resolu��o.

Aberturas das objectivas

O limite de resolu��o � fun��o da AN e do comprimento de onda m�dio da luz lempregue na observa��o. Assim, e dado pela

f�rmula:

e = 0,61 l ln. sen a

Sendo a luz amarelo esverdeada (l= 570nm) aquela para a qual o olho possui maior sensibilidade, e empregando uma objectiva de imers�o, atinge-se um limite de resolu��o de 250 nm (e = 0,61 x 570 / 1,4 = 250 ).

Pode ainda reduzir-se este limite, empregando uma ilumina��o ultravioleta, de comprimento de onda de 275 nm. As objectivas corrigidas para este comprimento de onda possuem todavia uma abertura num�rica ligeiramente mais fraca (1,25); nestas condi��es, o limite de resolu��o diminui e baixa a 130 nm. Contudo, a imagem n�o podendo ser observada directamente, � projectada numa emuls�o fotogr�fica.

Do que foi dito se deduz que o poder de resolu��o de um microsc�pio lhe � conferido exclusivamente pela objectiva. A ocular n�o pode acrescentar detalhes � imagem; a sua fun��o � apenas aumentar a dimens�o da imagem produzida pela objectiva.

Os microsc�pios fot�nicos empregues em biologia permitem a observa��o de objectos transparentes. A ilumina��o da prepara��o microsc�pica � obtida a partir de uma fonte de luz e atrav�s de um sistema �ptico designado por condensador, cuja abertura num�rica � superior � da objectiva e que actua condensando os raios luminosos provenientes da fonte.

Microscopio de contraste de fase

O microsc�pio de contraste de fase � uma variante do microsc�pio fot�nico, dotado de um sistema �ptico especial que transforma diferen�as de fase dos raios luminosos em diferen�as de intensidade. Deste modo, acentuando pequenas diferen�as de �ndice de refrac��o e de espessura existentes entre v�rios componentes celulares, o microsc�pio de contraste de fase possibilita o estudo de materiais vivos e n�o corados.

Este microsc�pio baseia-se no princ�pio de que a densidade de um corpo determina a velocidade com que a luz o atravessa e, consequentemente, o seu �ndice de refrac��o. Quando uma part�cula transparente, cujo �ndice de refrac��o � pr�ximo do meio envolvente, � atravessada por um raio luminoso, uma parte do raio atravessa sem se desviar (onda S), enquanto que outra parte se difracta e desvia (onda D). Nas prepara��es biol�gicas, a diferen�a de fase entre as ondas S e D � de � l, aproximadamente.

No microsc�pio de contraste de fase, o raio mais lateral que passa atrav�s da objectiva � adiantado de � l em rela��o � luz central, pela introdu��o de uma placa anelar na objectiva. Tamb�m no condensador se introduz um diafragma anelar. A placa anelar � um disco transparente com um sulco em forma de anel, que coincide com a imagem directa do condensador. O efeito de fase decorre da interfer�ncia entre a imagem geom�trica fornecida pela parte central da objectiva e a imagem difractada, dada pelos raios laterais, adiantada de � l .

Esquema de funcionamento do microsc�pio de contraste de fase

Essas diferen�as, transformadas em diferen�as de intensidade, traduzem-se por imagens luminosas �s quais a retina � sens�vel. O microsc�pio de contraste de fase � utilizado sobretudo para observar c�lulas vivas, nomeadamente c�lulas cultivadas.

Param�cia viva observada em contraste de fase

Microsc�pio de fluoresc�ncia

Omicrosc�pio de fluoresc�ncia permite estudar os constituintes celulares que manifestem autofluoresc�ncia, como por exemplo o caroteno, ou fluoresc�ncia secund�ria a eles transmitida por corantes especiais (fluorocromos). Denomina-se fluoresc�ncia a propriedade de certas subst�ncias que, ao serem excitadas por uma luz de comprimento de onda curto, emitirem luz de um comprimento de onda maior. Emprega-se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm, de forma a obterem-se radia��es emitidas na gama de 400 a 700 nm, isto �, dentro do espectro da luz vis�vel.

� com recurso a esta t�cnica que se evidenciam, por exemplo, os antigenes quando associados a anticorpos acoplados a mol�culas fluorescentes.

Ainda que em princ�pio qualquer microsc�pio possa ser adaptado para trabalhar em fluoresc�ncia, os melhores resultados obt�m-se com microsc�pios especialmente concebidos para este fim, nos quais as �pticas de vidro s�o substitu�das por lentes de quartzo, a fonte luminosa consiste numa l�mpada de vapor de merc�rio e, antes da ocular, se insere um filtro protector, para remover as radia��es ultravioletas, indesej�veis pelos danos que poderiam causar aos olhos do observador.

Microsc�pios estereosc�picos

Os microsc�pios estereosc�picos s�o habitualmente designados por lupas binoculares. Contrariamente aos outros, estes n�o se encontram limitados a observar por transpar�ncia, n�o sendo todavia exclu�do que o possam fazer. Recebem a luz reflectida pelo objecto e atingem geralmente amplia��es da ordem de 30 x.

Microsc�pio estereosc�pico (lupa binocular)

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